紫苏醇是一种具有广泛抗癌活性的单萜类化合物，目前主要依赖于植物提取和化学合成，但这些方法存在产量低、成本高以及环境污染等问题。近年来，随着代谢工程和合成生物学的发展，利用微生物合成紫苏醇及其前体化合物柠檬烯成为一种更具可持续性和工业可行性的替代方案。

          2025年4月25日，来自江南大学生物工程学院、工业生物技术教育部重点实验室的白仲虎教授与刘春立副研究员在《ACS Synthetic Biology》杂志发表了题为“Engineering Escherichia coli for Perillyl Alcohol Production with Reduced Endogenous Dehydrogenation”的研究论文，该团队通过代谢工程改造大肠杆菌，实现了从葡萄糖直接合成柠檬烯和紫苏醇，为高效生产这种重要化合物提供了新的思路。研究人员首先采用系统工程方法，优化了大肠杆菌中的甲羟戊酸（MVA）途径，以提高柠檬烯的合成效率。实验中，通过筛选不同来源的柠檬烯合成酶，发现来自柠檬（Citrus limon）的合成酶表现最佳，能够产生52.23 mg/L的柠檬烯。进一步通过截短柠檬烯合成酶的N端信号肽、优化核糖体结合位点（RBS）和调整基因表达强度等策略，柠檬烯产量显著提升至417.04 mg/L。在紫苏醇合成方面，团队引入了来自Mycobacterium sp. HXN-1500的细胞色素P450酶系统，并敲除了大肠杆菌内源的乙醇脱氢酶基因yqhD，以减少副产物的生成。最终，通过两相发酵技术，紫苏醇的产量达到了309.1 mg/L，这是目前摇瓶发酵系统中报道的最高水平。

图1. 从葡萄糖到柠檬烯和紫苏醇的生物合成路径

研究团队利用葡萄糖作为起始原料，通过引入甲羟戊酸（MVA）途径和柠檬烯合成酶（Ls），成功在大肠杆菌构建了从葡萄糖到柠檬烯的合成路径。柠檬烯合成酶是这一过程中的关键酶，研究团队通过筛选不同来源的柠檬烯合成酶，发现来自柠檬（Citrus limon）的合成酶在大肠杆菌中表现出最高的柠檬烯产量，达到52.23 mg/L，而来自薄荷（Mentha spicata）的合成酶产量为26.27 mg/L，来自黄果冷杉（Abies grandis）的合成酶则未能检测到柠檬烯的产生。

图2. 不同来源的柠檬烯合成酶以及MVA途径对柠檬烯产量的影响

随后，研究团队通过将GPP合成酶替换为NPP合成酶，进一步优化了合成路径，使柠檬烯的产量提高到75.68 mg/L，较之前增加了1.4倍。此外，通过调整MVA途径中基因的拷贝数，研究团队发现将某些基因从低拷贝数质粒转移到高拷贝数质粒可以显著提高柠檬烯的产量。这些结果表明，通过代谢工程手段优化合成路径中的关键酶和基因表达水平，可以显著提高柠檬烯的合成效率。

图3. 不同截短位置对柠檬烯合成酶（Cl(Ls)）的影响

 研究人员通过截短柠檬烯合成酶（Ls）的N端信号肽来优化其在大肠杆菌中的表达和活性。基于预测的转运肽序列，设计了6种不同截短位置的Ls突变体，以增强其在大肠杆菌中的异源表达效率。实验结果显示，截短至第7个氨基酸的Ls突变体（Lim-3）表现出最高的柠檬烯产量，达到139.91 mg/L，相比未截短的野生型酶提高了1.8倍。进一步截短则导致产量显著下降，例如截短至第12、17、31和52个氨基酸的突变体，其柠檬烯产量分别降至50.97 mg/L、15.14 mg/L、4.62 mg/L和几乎无法检测到的水平。这表明，适度截短N端信号肽可以显著提升Ls的催化效率，但过度截短则会破坏其功能，因此优化截短策略对于提高柠檬烯产量至关重要。

图4. 筛选合适的核糖体结合位点（RBS）以提高柠檬烯产量   

研究人员通过核糖体结合位点（RBS）工程和蛋白质融合策略进一步优化柠檬烯合成路径。首先，利用RBS计算器设计了不同翻译效率的RBS序列，并将其应用于NPP合成酶和Ls合成酶的表达优化。通过筛选19种不同的RBS组合，发现R3组合（NPP的RBS值为75,440，Ls的RBS值为135,307）表现出最高的柠檬烯产量，达到206.56 mg/L，相比之前的Lim-3菌株提高了1.47倍。此外，研究团队还尝试通过蛋白质融合策略将NPP和Ls更紧密地结合在一起，以提高底物利用效率，但实验结果显示，融合蛋白工程化的菌株（L1-L4）的柠檬烯产量略低于RBS优化的菌株。这表明，在本研究中，RBS工程比蛋白质融合策略更为有效。

  图5. 通过模块化设计和启动子工程优化柠檬烯合成路径      

进一步，研究人员通过模块化策略优化大肠杆菌中柠檬烯合成路径。通过将柠檬烯合成路径划分为三个模块：上游模块（mvaE和mvaS）、中游模块（mvK、pmK、mvaD和idi）以及下游模块（NPP和Ls）。通过调整各模块的表达强度和基因位置，研究团队逐步优化了整个代谢路径。首先，将Ls基因从单T7启动子转移到NPP下游，形成多顺反子结构，减少了表达载体上的基因表达盒数量，使柠檬烯产量达到248.85 mg/L。进一步将Idi基因转移到中游模块，使产量提高到300.85 mg/L。然而，当改变下游模块的表达载体拷贝数时，产量意外下降，表明过高的下游通量可能抑制了柠檬烯的积累。最终，通过在Ls的N端添加Cm29融合标签，进一步提高了柠檬烯产量至417.04 mg/L。这一结果表明，通过模块化设计和精细调控基因表达，可以有效提高柠檬烯的合成效率，为后续紫苏醇的合成提供了更高的前体供应。

图6. yqhD基因在紫苏醇生物转化中的作用及其对紫苏醛生成的影响

研究团队发现，大肠杆菌中乙醇脱氢酶（yqhD）基因的过表达会增加紫苏醇被氧化为紫苏醛的速率，而敲除yqhD基因则显著减少了紫苏醛的生成。实验中，野生型大肠杆菌在处理100 mg/L紫苏醇时产生了7.52 mg/L的紫苏醛，而yqhD敲除菌株仅产生3.89 mg/L紫苏醛，降低了52.91%。相反，yqhD过表达菌株的紫苏醛产量增加到10.19 mg/L。通过体外酶活性测定，研究团队确定了YqhD催化紫苏醇转化为紫苏醛的最佳条件：pH 9.0和温度30°C。在此条件下，YqhD的催化效率较高，其动力学参数表明对紫苏醇具有较强的亲和力（Km = 1.26 mM）和较高的催化效率（kcat/Km = 16.22 min⁻¹·mM⁻¹）。这些结果表明，yqhD在紫苏醇的氧化过程中起着关键作用，通过敲除yqhD基因可以有效减少副产物紫苏醛的生成，从而提高紫苏醇的产量。

图7. 优化后的代谢途径在摇瓶发酵中紫苏醇的产量 

最后，研究团队将细胞色素P450酶系统（Cyp450）整合到大肠杆菌中，并通过敲除yqhD基因减少了紫苏醛的生成，从而提高了紫苏醇的产量。研究中，yqhD敲除菌株（POH-2）在摇瓶发酵中产生了52.37 mg/L的紫苏醇，相比野生型菌株（POH-1）提高了31.35%。进一步增加电子传递蛋白Fdx的表达，使紫苏醇产量提升至117.58 mg/L。在优化发酵条件后，通过添加10%的DINP（邻苯二甲酸二异壬酯）作为覆盖层，紫苏醇产量进一步提高至173.6 mg/L。此外，研究团队还发现，调整葡萄糖浓度对紫苏醇产量有显著影响。在15 g/L葡萄糖条件下，紫苏醇产量达到最高值309.1 mg/L，这是目前摇瓶发酵系统中报道的最高水平，为进一步工业化生产奠定了基础。    

总之，这项工作不仅成功构建了一种高效合成紫苏醇的大肠杆菌细胞工厂，还揭示了减少副产物形成对于提高目标产物产量的关键作用。通过代谢工程手段，研究团队不仅优化了柠檬烯的合成途径，还通过敲除关键基因和增强电子传递效率，显著提高了紫苏醇的合成效率。这一成果不仅为紫苏醇的工业化生产奠定了基础，也为其他萜类化合物的微生物合成提供了重要的参考。未来，随着更多代谢工程策略的开发和应用，有望进一步提高紫苏醇的产量，推动其在医药领域的广泛应用，为可持续生物制造和绿色化学发展做出贡献。

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