大肠杆菌实验室常用培养基简述

  • 作者:来源:食药信息论坛
  • 时间:2022-11-21
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   大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常称为大肠杆菌,其在Escherich于1885年发现后,因其具备能够方便的易于培养和传代且生长速率快,营养需求简单等优势,并具备完整的基因组序列信息和清晰的遗传学背景,目前被广泛运用于基因工程领域,其中胰岛素规模化生产是大肠杆菌作为合成生物学运用的第一个市场化产品。

   培养基,作为细胞的"食物",是细胞培养和发酵的基础,大肠杆菌伴随培养基成分的变化也会产生不同的性状。可以根据其表现出的不同性状,将部分菌种进行特异性识别,同时也可以通过为目标菌种选择合适的培养基来实现低成本、高表达以及稳定结构的表达,对某种特定产物进行特异性培养。

   大肠杆菌分离培养基在实验室环境下,制备大肠杆菌培养基主要是为了保证菌种的生长和繁殖。接下来菌菌就以LB琼脂、伊红美蓝琼脂(EMB)、麦康凯琼脂等为例,从分离培养基的角度出发进行介绍。

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1. LB琼脂

   Luria broth(LB)营养液混合琼脂通常简称LB琼脂,是一种富含营养(酵母提取物、胰化蛋白胨和NACI)的非选择性固体培养基,通常用于培养实验室中的细菌。在LB中加入琼脂会形成一种凝胶,可以使细菌在其表面生长,因为细菌不能消化琼脂,却可以吸收LB营养液中的营养。

   在这种凝胶中加入一种抗生素(如青霉素、四环素、卡那霉素等),可以选择选择性培养对其耐药的细菌并去除杂菌,选择性培养的菌体的抗性是由携带抗生素抗药性基因的质粒赋予的。例如在大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备过程中,就会将含有氨苄青霉素的LB培养基作为筛选所需质粒的大肠杆菌的培养基。

2.伊红美蓝琼脂(EMB)

   伊红美蓝培养基通常简称EMB medium,为弱选择性培养基,主要用于大肠杆菌和产气肠杆菌的分离和鉴别,也适用于大肠菌群的分离培养。

   其配方中各主要成分的作用为:蛋白胨提供碳源和氮源;乳糖是大肠菌群发酵的糖类;磷酸氢二钾是缓冲剂;琼脂是培养基凝固剂;伊红(Eosin Y)也称曙红或四澳荧光素,为酸性染料:美兰(eosin-methylene blue) ,也叫亚甲蓝(C16H18N3S.CI) ,为碱性染料,二者在培养基中均为指示剂。

   当大肠杆菌分解乳糖产酸时,细菌带正电,所以染上红色,再与美兰结合而形成紫黑色菌落,并带有金属光泽;产气肠杆菌则呈棕色,很少有金属光泽,同时不分解乳糖的细菌,如沙门氏菌和志贺氏菌,则为无色或琥珀色半透明菌落;凝固酶阳性葡萄球菌为无色针尖大小的菌落;白色念珠菌则为蛛丝状或羽毛状菌落。

3.麦康凯琼脂(MacConkey Agar )

   麦康凯琼脂常见缩写MAC琼脂,检验分离肠道菌最常用的培养基,在药典中用于大肠杆菌的检测,在食品标准用于肠道致病菌的分离。

   培养基中较多的胆盐及结晶紫对大多数革兰氏阳性菌有很强的抑制效果,大肠杆菌由于强烈发酵乳糖产酸,在培养基上菌落为桃红色,并且菌落周围通常有明显的沉淀环,大肠菌群同样能发酵乳糖产酸,菌落也为桃红色,致病性的肠道菌则通常因不发酵乳糖(如志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌等),菌落则呈无色。此培养基由于对大肠杆菌的专一性较弱(大肠菌群和大肠杆菌的菌落特征比较接近),若样品中大肠菌群的含量比较高,分离大肠杆菌的效果并不理想。

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大肠杆菌发酵培养基

   发酵培养基是指为了在生产中更加适应菌种后续产物生成以及代谢废物的产生而设计的培养基。

   例如,前面提到过的LB培养基除了是添加抗生素以筛选带有所需质粒的分离培养基外,其本身也是一种较为常用的发酵培养基,在此便不再赘述。

其他常用的培养基有SOB(Super Optimal Broth)培养基、SOC(Super Optimal broth with Catabolite repression)培养基、TB(Terrific Broth)培养基等。

1.SOB(Super Optimal Broth)培养基

   SOB培养基是另一种富营养培养基。与LB培养基相比, SOB培养基中含有两倍多蛋白胨,蛋白胨中富含氨基酸及多肽。另外,SOB培养基中含有镁离子,镁离子是高密度培养必须的离子。利用SOB培养基培养大肠杆菌在普通条件(250rpm)下摇瓶培养,菌浓可达到OD600 3-5左右,如果提高转速到350rpm, OD600最高能够达到10-15。在SOB培养基中的大肠杆菌具有更高的转化效率,因此常用SOB培养基制备感受态细胞。

SOB培养基的配方如下: 2%胰蛋白陈,0.5%酵母提取物,10mM NaCI,2.5mM KCI,10mM MgCI2,10mM MgSO4

2.SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression)培养基

   SOC培养基跟SOB培养基的唯一区别是SOC中包含有20mM葡萄糖(glucose)。培养基中的葡萄糖充当分解代谢抑制物(catabolite repressor)。大肠杆菌更倾向应用葡萄糖作为碳源。因此在葡萄糖存在的情况下,其他的碳源的分解就会被抑制。在20mM葡萄糖存在下,乳糖不会被代谢,乳糖操纵子被抑制,外源基因不会发生表达,这就减少了外源基因表达给细胞带来的生长压力。因此,利用SOC培养基进行转化反应时,热激后细胞生长的速率会比LB培养基中高出很多。当实验室中没有储存SOC培养基时,在LB中加入20mM葡萄糖,效果是一样的。

SOC培养基配方如下: 2%胰蛋白胨,0.5% 酵母提取物,10mM NaCI,2.5mM KCI,10mM MgCI2,10mM MgSO4, 20mM葡萄糖

3.2x YT (Yeast extract and Tryptone)培养基

   2x YT培养基是比LB培养基营养更为丰富的培养基。与LB培养基成分相比, 2xYT培养基中包含有更多的的酵母提取物和胰蛋白胨。因为培养基中营养更丰富了,细胞能够生长更长的时间,浓度达到更高的值。2x YT培养基主要用来进行大肠杆菌以及像是M13这样的细菌噬菌体的培养。由于大肠杆菌的浓度很高,在生产大量的噬菌体的同时,宿主仍然是存活的。

   2x YT培养基的配方如下: 1.6%胰蛋白胨,1%酵母提取物,0.5% NaCl

2.MBL培养基

   MBL培养基是以葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、KHPO4、(NH4)2HPO4、MgSO4为主要成分的发酵培养基。

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总结

    为了支持更好的进行细胞筛选以及发酵表达,对于培养的选择和成分的控制是至关重要的。只有通过不断优化组成成分,物理化学特性,获得能进行大规模表达抗体的稳定的培养基。培养基原料的选择对培养基质量及稳定性控制也很重要。

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